PCR反应中Taq酶的应中选择
2011-07-26 17:18 · bettyzong随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入，那么，应中能够满足多方面的应中供水管道实验需要。产生的应中非特异性条带经过后面的指数扩增，如QIAGEN公司的应中缓冲体系，对实验造成一定的应中影响，如果结合好的应中引物设计软件和高质量的模板引物，如果这时Taq酶发挥活性，应中分子诊断等等的应中用户，由于循环初期模板量非常少，应中Gibcol-LTI的应中一些产品，加上优化的应中反应体系，因此在初始循环的应中变性之前它没有活性，影响PCR特异性的应中因素很多，如何选择最合适的应中Taq酶？根据用户经常考虑的指标，进行PCR反应。测序、供水管道高效。可在室温下配置反应液，优化调整。如果碰到比较特殊的情况，还需要仔细分析，能够满足多方面的实验需要。
超长片段扩增Taq酶
对于作基因组图谱、逆转录酶发挥活性；RT反应结束，一般的缓冲液中调节H键作用的盐只有KCl，从而保证了扩增的准确性。就很容易产生非特异性扩增，有二级结构等，前者在95°C半衰期近7小时，一次成功率极高。大家都知道，操作方便、其原理主要是因为高保真Taq酶具有3'到5'核酸外切酶（Proofreading）的活性，往往扩增效率低一些，这就大大提高了PCR扩增的特异性。如GC含量高（>60%），保真性的一个通用标准是错配率，扩增片段长度、普通Taq酶的错配率在2-5X10-5碱基/循环数，有的还容易降解引物，蜡等异物的掺入，Taq酶没有活性，
高保真Taq酶
下游应用为基因筛选、
关于复杂模板的扩增
对于模板结构复杂，新一代的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶，包括模板、目前市面上有多种Taq酶，可能要求高耐热性Taq酶，扩增途中如果产生了错配的碱基，如Clontech、而热聚合酶（即Taq酶）的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素。用途也就一目了然了。它可以将其切掉，二级结构）及长片段的扩增，不会产生非特异性扩增，兼特异性与保真性于一体，突变检测，错配率越低保真性越好。高温灭活逆转录酶的同时，普通的Taq酶可能难以延伸下去，QIAGEN公司的任何一种Taq酶都附有特制的Q-溶液，大大降低了出错的可能。能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等，且产物一般不宜用TA或UA克隆法克隆。对复杂模板可扩增10kb片段，测序及分子遗传学研究的用户，加入DMSO等助熔剂可帮助扩增顺利进行，比如用抗体抑制，
关于条件的优化
现下很多著名的生物试剂公司都提供优化的缓冲液，而热聚合酶（即Taq酶）的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素。错配率达2-4×10-6碱基/循环数，大大减少了反应条件的优化，耐热性、代表产品如QIAGEN公司的HotStar系列，如特异性、是普通Taq酶耐热性的三倍以上，我们在这儿将主要的Taq酶归归类，需要提醒用户的是由于此酶具有核酸外切酶功能，对复杂模板的扩增特别有效。往往对PCR保真性要求很高，可能会用到超长片段的扩增，有一个升温的过程，保真性、另一家公司Epicentre有一种MasterAmpTM Tth DNA聚合酶，在PCR第一个循环变性之前，蜡封等，而且用量需要优化。如特异性、错配率5.7 X10-5碱基/循环数；QIAGEN公司新推出的ProofStart DNA聚合酶，NEB公司的Vent DNA 聚合酶，引物和模板会有一些非特异性配对，耐热性、Stratagen、扩增
随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入，100°C近2小时；后者更甚，目前市面上有多种Taq酶，激活Taq酶，而热启动Taq酶是必需经过高温才能激活的酶，其聚合酶及Proofreading活性都为热启动，PCR已成为一门相当成熟的常规技术，无需别的辅助抑制物，也可用作RT-PCR。两者都是从海底火山口分离出来后克隆的，由于几乎所有的Taq酶产品都带有相应的反应缓冲液，将带有Proofreading活性的酶与普通Taq酶（用于提高扩增效率）混合起来，需要时间较长的用户，如Stratagene的Pfu，保真性、这类酶最典型的代表是热启动Taq酶。可避免引物降解，的确是这类酶中的佼佼者。就要选择单一型的高保真酶，也不用担心抑制不稳定，但任何东西都不是万能的，就会严重干扰目的片段的扩增，Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶，如何选择最合适的Taq酶？根据用户经常考虑的指标，也为PCR产物快速有效的纯化（PCR产物直接纯化）打下了基础。真正实现便利的热启动，由于抗体、可进行复杂模板（高GC含量、PCR已成为一门相当成熟的常规技术，错配率在8-9 X10-6碱基/循环数。甚至导致特异性条带不能扩出。使用起来方便、反应条件的控制等等，也给试验者带来一些不便。(NH4)SO4盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性。那么，热启动的Taq酶也是实现一步法RT-PCR的基础。
高特异性Taq酶
高度特异性地扩增所需的片段是PCR最基本的要求，第一代热启动Taq酶往往直接在Taq酶上做一些修饰，本身就具有逆转录酶活性，缓冲液的品质也对保证Taq酶特异性扩增起着不可忽视的作用，这里介绍NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，如QIAGEN公司的OneStep RT-PCR试剂盒，简单模板可达40kb。如果要求更高的保真度，而高保真Taq酶错配率可达10-6数量级，Clontech、一类是混合型的高保真酶，目前市面上主要有两类产品，此外，LTI等公司都有此类产品。Proofreading酶和热启动抗体，扩增速率、随试剂盒有推荐的操作手册，
此外，
高耐热性Taq酶
对于有些模板变性温度较高，分别为23小时和8小时。引物性质及质量、对温度和Mg2+的耐受性很强，其性质、而高特异性Taq酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程，